Titel: Molekulare Analyse SHANK-assoziierter Synaptopathien
Sonstige Titel: Molecular analysis of SHANK-associated synaptopathies
Sprache: Deutsch
Autor*in: Woike, Daniel
GND-Schlagwörter: SynapseGND
AutismusGND
NeurobiologieGND
BiochemieGND
EntwicklungsstörungGND
Erscheinungsdatum: 2022
Tag der mündlichen Prüfung: 2022-08-19
Zusammenfassung: 
Neurologische Erkrankungen, die auf eine synaptische Fehlfunktion zurückzuführen sind, werden als Synaptopathien bezeichnet. Dazu zählen neurologische Entwicklungsstörungen wie Autismus-Spektrum-Störungen, Schizophrenie oder Epilepsie. Die Mitglieder der Shank-Proteinfamilie (Shank1-3) gehören zu den wichtigsten Gerüstproteinen der postsynaptischen Dichte exzitatorischer Synapsen. Mutationen in den SHANK-Genen sind dabei häufig mit Autismus-Spektrum-Störungen (ASS), Schizophrenie oder geistiger Behinderung assoziiert. Der heterozygote Verlust von SHANK3 verursacht das Phelan-McDermid-Syndrom, welches mit einer starken geistigen Behinderung und Autismus einhergeht. Interessanterweise betreffen die meisten ASS-assoziierten SHANK3-missense-Mutationen nicht die Kerndomänen von Shank (die PDZ- sowie die SAM-Domäne), sondern den Shank3-N-Terminus. Die Auswirkungen dieser Mutationen auf molekularer Ebene sind allerdings noch nicht ausreichend erforscht. Jedoch weisen die Genveränderungen bei autistischen Patienten auf eine wichtige, bisher noch nicht verstandene Rolle der N-terminalen Domänen (SPN-Domäne und Ankyrin-Wiederholungen (Ank)) von Shank3 für die Gehirnentwicklung hin.
Diese Arbeit widmet sich der Frage, wie einzelne missense-Mutationen in SHANK-Genen zu neurologischen Entwicklungsstörungen wie Autismus führen können. Hierfür wurden neun bisher unerforschte missense-Mutationen, die den Shank3-N-Terminus betreffen, im Hinblick auf bekannte molekulare Interaktionen mittels Ko-Immunopräzipitationsexperimenten in HEK293T-Zellen analysiert. Für diese missense-Mutationen konnten zwei wesentliche Effekte abgeleitet werden: (1) eine verringerte Bindung an δ-Catenin sowie (2) Interferenz mit der Tandemfaltung des Shank3-N-Terminus durch eine Störung des intramolekularen Kontakts zwischen SPN- und Ank-Domäne. Im Falle der ASS-assoziierten Mutation P141A bedingt die Öffnung der Tandemstruktur eine Beeinträchtigung der Interaktion mit der α-Untereinheit der Ca2+-/Calmodulin-abhängigen Proteinkinase II (CaMKIIα) sowie eine verstärkte Bindung an α-Fodrin. Die fluoreszenzmikroskopische Analyse ergab zudem, dass die P141A-Mutation die Kapazität von Shank3, in hippocampalen Neuronen postsynaptische Cluster zu bilden, herabsetzt. Interessanterweise führt auch die Expression eines Shank3-Proteins ohne die SPN-Domäne in Neuronen zu einer geringeren Dichte an synaptischen Shank3-Clustern in dendritischen Dornen und zu einer erhöhten Dichte an Shank3-Clustern auf dem dendritischen Schaft. Die Analyse verschiedener N-terminaler Shank3-Varianten in HEK293T-Zellen zeigt außerdem, dass freie Ank-Domänen intermolekular interagieren und Proteincluster bilden, während die Abschirmung der Ank-Wiederholungen durch die SPN-Domäne diese Interaktionen mehrheitlich verhindert. Ausgehend von diesen Ergebnissen kann ein neuer Pathomechanismus für die Entstehung von Autismus-Spektrum-Störungen abgeleitet werden: Die Freilegung der Ank-Domäne, beispielsweise durch einen mutationsbedingten Verlust der abschirmenden Wirkung der SPN-Domäne, ermöglicht intermolekulare Ank-Ank-Interaktionen, welche die Synapsenbildung beeinträchtigen.
Basierend auf meinen Interaktionsstudien besteht eine weitere Funktion der SPN-Ank-Tandemfaltung in der Bereitstellung einer Bindungsstelle für die CaMKIIα. Die Untersuchung der Aktivierung der CaMKIIα in der postsynaptischen Dichte von Shank3αβ-knockout-Mäusen beleuchtet zudem die physiologische Relevanz der Interaktion zwischen Shank3 und der CaMKIIα: Shank3 inhibiert über den N-Terminus die Aktivierung der CaMKIIα und kann dementsprechend als negativer Regulator der CaMKIIα-vermittelten Signaltransduktion interpretiert werden.
Um das Verständnis der molekularen Pathomechanismen SHANK-assoziierter Synaptopathien auf die Kerndomänen der Gerüstproteine auszudehnen, charakterisierte ich zwei neu identifizierte SHANK2-missense-Mutationen (G643R, L1800W), welche die PDZ- bzw. die SAM-Domäne betreffen. Beide Mutationen führen zu schwerwiegenden neurologischen Entwicklungsstörungen. Die Analyse von G643R und L1800W in hippocampalen Neuronen mittels konfokaler und hochauflösender Mikroskopie zeigte, dass beide Mutationen mit dem postsynaptischen targeting von Shank2 sowie mit der nanoscale-Organisation der postsynaptischen Dichte interferieren. Im Rahmen dieser Arbeit konnten somit erstmalig mutationsbedingte Veränderungen in der Organisation der Nanocluster der postsynaptischen Dichte mit einer Störung der mentalen Gesundheit in Verbindung gebracht werden.

Neurological disorders resulting from synaptic dysfunction are called synaptopathies. These include neurodevelopmental disorders such as autism spectrum disorders, schizophrenia or epilepsy. Shank protein family members (Shank1-3) are among the major scaffolding proteins of the postsynaptic density of excitatory synapses. Mutations in the SHANK genes are frequently associated with autism spectrum disorders (ASD), schizophrenia or intellectual disability. Heterozygous loss of SHANK3 causes Phelan-McDermid syndrome, which is associated with severe intellectual disability and autism. Interestingly, most ASD-associated SHANK3 missense mutations affect the Shank3 N-terminus rather than the core domains of Shank (the PDZ as well as the SAM domain). The effects of these mutations have not been adequately explored at the molecular level. The gene alterations in autistic patients indicate an important, as yet not understood, role of the N-terminal domains (SPN domain and Ankyrin repeats (Ank)) of Shank3 in brain development.
This work addresses the question of how single missense mutations in SHANK genes can lead to neurodevelopmental disorders such as autism. For this, nine previously unexplored missense mutations affecting the Shank3 N-terminus were analyzed in terms of known molecular interactions using co-immunoprecipitation experiments in HEK293T cells. Two major effects could be observed: (1) loss of binding to δ-catenin and (2) interference with tandem folding of the Shank3 N-terminus by disrupting the intramolecular contact between the SPN domain and the Ank repeats. In the case of the ASD-associated mutation P141A, the opening of the tandem structure causes an impairment of the interaction with the α-subunit of Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II (CaMKIIα) and an enhanced binding to α-Fodrin. Fluorescence microscopy also revealed that the P141A mutation decreases the capacity of Shank3 to form postsynaptic clusters in hippocampal neurons. Interestingly, expression of a Shank3 protein lacking the SPN domain also results in a lower density of synaptic Shank3 clusters in dendritic spines and in an increased density of Shank3 clusters on the dendritic shaft. Analysis of different N-terminal Shank3 variants in HEK293T cells also shows that free Ank domains interact intermolecularly and form protein clusters, whereas the blockade of Ank repeats by the SPN domain mainly prevents these interactions. Based on these results, a new pathomechanism for the development of autism spectrum disorders can be deduced: Exposure of the Ank domain, for example through a mutation-induced loss of the SPN domain's shielding effect, enables intermolecular Ank-Ank interactions that impair the role of Shank3 in synapse formation.
Based on my interaction studies, another function of the SPN-Ank tandem fold is to provide a binding site for the CaMKIIα. Furthermore, the study of CaMKIIα activation in the postsynaptic density of Shank3αβ-knockout mice sheds light on the physiological relevance of the interaction between Shank3 and the CaMKIIα: Shank3 inhibits CaMKIIα activation via the N-terminus and, accordingly, can be interpreted as a negative regulator of CaMKIIα-mediated signalling.
To extend our understanding of the molecular pathomechanisms of SHANK-associated synaptopathies to the core domains of the scaffold proteins, I characterized two newly identified SHANK2 missense mutations (G643R, L1800W) affecting the PDZ and SAM domains, respectively. Both mutations lead to severe neurodevelopmental disorders. Analysis of G643R and L1800W in hippocampal neurons using confocal and high-resolution microscopy revealed that both mutations interfere with postsynaptic targeting of Shank2 as well as with nanoscale organization of the postsynaptic density. Thus, in this work, mutation-induced changes in postsynaptic density nanocluster organization could be linked to a mental disorder for the first time.
URL: https://ediss.sub.uni-hamburg.de/handle/ediss/9781
URN: urn:nbn:de:gbv:18-ediss-102827
Dokumenttyp: Dissertation
Betreuer*in: Kreienkamp, Hans-Jürgen
Enthalten in den Sammlungen:Elektronische Dissertationen und Habilitationen

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