Chaperone-mediated autophagy in neuronal dendrites recruits cargo for local activity-dependent lysosomal release

Abstract

Neurons are complex, polarized cells that exhibit a specialized morphology adapted to their key function in synaptic transmission. The synaptic activity results in a tremendous protein turnover at the neuronal contact sites, which can be localized at great distances from the cell body. For a long time, the existence of the degradation machinery was thought to be restricted to the soma of neurons, in particular the presence of lysosomes. Lysosomes are highly acidified organelles responsible for the digestion of numerous molecules to maintain proteostasis, reflecting the catabolic center of the autophagic, as well as endolysosomal pathways. The abundance of lysosomes in the axonal and dendritic compartment has been a matter of debate and local catabolic processes, especially in connection to synaptic function, have not been studied in much detail. More recently, intriguing evidence was provided for the abundance of mature lysosomes in dendrites. It was thereby demonstrated that lysosomal trafficking was regulated by neuronal activity and activity-dependent lysosomal fusion with the plasma membrane resulted in dendritic spine growth, implicating their potential contribution to synaptic plasticity. Despite these findings, the molecular identity of dendritic lysosomes and their functional connection to neuronal function is barely understood. The present work aimed to gain a better understanding of lysosomal populations in the dendritic compartment of neurons. To this end, the two most commonly used lysosomal markers of the family of lysosome-associated membrane proteins (LAMPs), LAMP1 and LAMP2, were utilized to study lysosomal distribution, motility and maturity, including the presence of hydrolases. To further investigate the link between neuronal activity and lysosomal function, the activity of GluN2B-containing N-methyl-D-aspartate receptors (NMDARs), which are important glutamate receptors involved in synaptic plasticity, were studied in regard to lysosomal trafficking and potential fusion. The obtained results highlight the presence of highly heterogeneous lysosomal populations with distinct trafficking patterns, with LAMP1 and LAMP2 serving as markers for different lysosomal pools. Interestingly, it could be demonstrated that the activation of NMDARs led to the stalling, as well as exocytosis, of LAMP2-, but not LAMP1-positive lysosomes in the proximity of the GluN2B subunit. Furthermore, conducted biochemical assays revealed that the cytoplasmic tail of LAMP2 directly binds to the SH3-GK module of SAP102, a GluN2B scaffold protein. SAP102 and GluN2B are located not only at synapses but also at extrasynaptic sites and the involvement of the extrasynaptically located pool of GluN2B-containing NMDARs in the stalling and fusion of LAMP2-positive lysosomes was suggested. Moreover, evidence was provided for the presence of chaperone-mediated autophagy (CMA) processes in dendrites. In CMA, a wide range of intracellular proteins that contain a KFERQ-like motif are recognized by the chaperone protein Hsc70 and subsequently translocated to the lysosomal lumen by the obligatory receptor LAMP2A. The studied lysosomal pool was not only shown to be associated with CMA machinery but also a known CMA target, TAR DNA-binding protein 43 (TDP-43), was found to be localized to the acidified LAMP2-positive lysosomes in dendrites. Further, the activation of NMDARs resulted in a release of TDP-43 from neuronal cells. In summary, the data provide evidence for the existence of heterogeneous dendritic lysosomal pools as well as the presence of a novel mechanism of CMA-substrate release upon the activity-dependent fusion of dendritic LAMP2-containing lysosomes with the plasma membrane. The release of lysosomal content, including active hydrolases, could, in consequence, allow for synaptic remodeling, unveiling a new function of lysosomes in dendrites and their connection to neuronal plasticity.

Neuronen sind komplexe, polarisierte Zellen, die eine spezialisierte Morphologie aufweisen, angepasst an ihre Hauptfunktion der synaptischen Transmission. Die synaptische Aktivität resultiert in einem enormen Umsatz an Proteinen an den neuronalen Kontaktstellen, welche sich in großer Entfernung vom Zellkörper befinden können. Es wurde lange Zeit angenommen, dass die Existenz der Abbaumaschinerie auf das Soma der Neuronen beschränkt ist, insbesondere das Vorkommen von Lysosomen. Lysosomen sind stark angesäuerte Organellen, die für die Verdauung zahlreicher Moleküle zur Aufrechterhaltung der Proteostase verantwortlich sind und das katabolische Zentrum des autophagischen sowie des endolysosomalen Weges darstellen. Die Existenz von Lysosomen im axonalen und dendritischen Kompartiment war hingegen umstritten, und die lokalen Abbauprozesse, insbesondere im Zusammenhang mit der synaptischen Funktion, nicht detailliert untersucht. Vor kurzer Zeit wurde allerdings die Abundanz von reifen Lysosomen in Dendriten gezeigt. Dabei wurde nachgewiesen, dass der lysosomale Transport durch neuronale Aktivität reguliert wird und dass die aktivitätsabhängige Fusion von Lysosomen mit der Plasmamembran zum Wachstum dendritischer Dornen führt. Dies deutet auf einen möglichen Zusammenhang zur synaptischen Plastizität hin. Trotz dieser Erkenntnisse ist weder die molekulare Identität der dendritischen Lysosomen noch ihre funktionelle Verbindung zur neuronalen Funktion hinreichend erforscht. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, ein fundiertes Verständnis über die lysosomalen Populationen im dendritischen Kompartiment von Neuronen zu erlangen. Zu diesem Zweck wurden die beiden am häufigsten verwendeten lysosomalen Marker aus der Familie der Lysosomen-assoziierten Membranproteine (LAMPs), LAMP1 und LAMP2, verwendet, um die lysosomale Verteilung, Motilität und Reife, einschließlich der Anwesenheit von Hydrolasen, zu untersuchen. Um den Zusammenhang zwischen neuronaler Aktivität und lysosomaler Funktion weiter zu beleuchten, wurde die Aktivität von GluN2B-haltigen N-Methyl-D-Aspartat-Rezeptoren (NMDARs) im Hinblick auf den lysosomalen Transport und die mögliche Fusion untersucht. Diese NMDARs sind wichtige Glutamatrezeptoren, die eine wichtige Rolle bei der synaptischen Plastizität spielen. Die vorgelegten Ergebnisse veranschaulichen heterogene lysosomale Populationen mit unterschiedlichen Bewegungsmustern, wobei LAMP1 und LAMP2 als Marker für verschiedene lysosomale Pools dienen. Interessanterweise führte die Aktivierung von NMDARs zum Stoppen sowie zur Exozytose von LAMP2-, aber nicht von LAMP1-positiven Lysosomen in unmittelbarer Umgebung der GluN2B-Untereinheit. Darüber hinaus zeigten biochemische Untersuchungen, dass die zytoplasmatische Sequenz von LAMP2 direkt an das SH3-GK-Modul von SAP102, einem GluN2B-Gerüstprotein, bindet. Da SAP102 und GluN2B nicht nur an Synapsen, sondern auch an extrasynaptischen Stellen zu finden sind, wurde die Beteiligung des extrasynaptisch gelegenen Pools von GluN2B-haltigen NMDARs am Stoppen und der Fusion von LAMP2-positiven Lysosomen vermutet. Darüber hinaus wurde das Vorkommen von Prozessen der „chaperone-mediated autophagy“ (CMA) in Dendriten gezeigt. Bei der CMA wird ein breites Spektrum intrazellulärer Proteine, die ein KFERQ-ähnliches Motiv enthalten, durch das Chaperonprotein Hsc70 erkannt und anschließend durch den obligatorischen Rezeptor LAMP2A in das lysosomale Lumen transloziert. Die Ergebnisse belegen nicht nur eine Assoziation des untersuchten lysosomalen Pools mit der CMA-Maschinerie, sondern auch, dass ein bekanntes Zielprotein der CMA, das TAR-DNA-bindende Protein 43 (TDP-43), in den angesäuerten LAMP2-positiven Lysosomen in Dendriten lokalisiert ist. Darüber hinaus führte eine Aktivierung von NMDARs zu einer Freisetzung von TDP-43 aus neuronalen Zellen. Zusammengenommen stellt die vorliegende Arbeit die Existenz heterogener dendritischer lysosomaler Pools dar und beschreibt einen neuartigen Mechanismus zur Entsorgung von Zielproteinen der CMA durch die aktivitätsabhängige Fusion von dendritischen LAMP2-haltigen Lysosomen mit der Plasmamembran. Die Freisetzung lysosomaler Inhalte, einschließlich aktiver Hydrolasen, könnte folglich den synaptischen Umbau ermöglichen, was eine neue Funktion von Lysosomen in Dendriten und ihre Verbindung zur neuronalen Plastizität enthüllt.