Analysis of brain-derived extracellular vesicles in steady-state conditions and after ischemic stroke

Abstract

Extracellular vesicles (EVs) are lipid bilayer enclosed structures, formed via the endocytic pathway (exosomes) or shed from the plasma membrane (ectosomes/microvesicles). EVs are powerful communication tools, as they can be taken up by recipient cells, transferring their cargo composed by proteins, nucleic acids, and lipids. The cargo reflects the status of the cell of origin and, as EVs are found in body fluids, they are very promising biomarkers. EVs are involved in physiological and pathological processes in the Central Nervous System (CNS), playing a role in disease progression and recovery. To be studied, EVs are isolated either from cell-conditioned media, body fluids, and tissue. Ischemic stroke occurs when a brain artery is occluded, causing a lack of blood flow and subsequent lack of oxygen and glucose supply in the affected area. The cells at the core of the infarct die immediately, while neurons in the surrounding area could be rescued, depending on the signals received in the next hours/days. The pathophysiology of stroke is complex, involving different brain and infiltrating cells, which are in close communication with each other, possibly also by EVs. In this thesis, EVs isolated from the brain of mice subjected to transient Middle Cerebral Artery Occlusion (tMCAO, mouse model of stroke) and sham controls together with healthy mice, were analyzed at proteomic and transcriptomic levels. We reported that small brain-derived EVs (sBDEVs; ≤200nm) from healthy mice are enriched in ribosomal proteins, while large BDEVs (≥200nm) carry more proteins related to metabolic pathways. We confirmed the ribosomal protein enrichment also by re-analysing the proteome of BDEVs published in other studies using different isolation protocols. We saw that in steady-state conditions microglia are the main contributors to the BDEVs pool. 24h after stroke, astrocytes increase significantly their EVs release, possibly in relation to glial scar formation, neuronal survival, and/or microglial activation. Differently, there is a significant increase of oligodendrocyte-derived EVs 72h after stroke, a time when recovery processes such as remyelination start to take place. At a transcriptomic level, BDEVs isolated 72h after stroke carry mRNAs that are related mainly to inflammatory response and stress defense, but also to recovery processes. These mRNAs are mostly released by microglia. Moreover, we found that the most upregulated mRNAs after stroke are present in the EVs as full-length, and therefore potentially translatable in the recipient cells. How EVs reach the target cell and how they deliver their cargo are still unanswered questions. We saw that the presence of prion protein (PrP) on the surface of BDEVs influences their uptake by recipient cells, as EVs carrying PrP behaved differently to EVs lacking PrP. We demonstrated that PrP is significantly increased in BDEVs 24h after stroke/reperfusion, and we hypothesize a role for PrP in EVs’ fusion with the plasma membrane of the recipient cells, which could influence stroke. Lastly, we showed that activated human CD8T cells release EVs containing CD73, which has AMPase activity and activity and can degrade to adenosine the AMP resulting from ADP and ATP. This purinergic signaling cascade is fundamental for immune regulation during inflammation and ischemia, where the levels of extracellular ATP are critical and EVs seem pivotal for its degradation.

Extrazelluläre Vesikel (EV) sind von einer Lipiddoppelschicht umschlossene Strukturen, die entweder im endosomalen System gebildet (Exosomen) oder direkt von der Plasmamembran freigesetzt werden (Ektosomen/Mikrovesikel). EV gelten als wichtiges interzelluläres Kommunikationsmittel. Durch Aufnahme von Empfängerzellen kann ihre Ladung, bestehend aus Proteinen, Nukleinsäuren und Lipiden der Ursprungszelle, so weitergegeben werden. Da EV in Körperflüssigkeiten vorkommen, sind sie vielversprechende Biomarker verschiedener Erkrankungen. Sie sind an zahlreichen (patho-)physiologischen Prozessen im zentralen Nervensystem (ZNS) beteiligt. Um EV untersuchen zu können, müssen sie entweder aus Zellkulturüberständen oder Körperflüssigkeiten wie dem Liquor isoliert werden. Seit kurzem ist es außerdem möglich, EV aus Gehirnen aufzureinigen. Ein ischämischer Schlaganfall tritt auf, wenn sich eine Hirnarterie verschließt und es durch den Mangel an Blutfluss folglich zu einer Minderversorgung mit Sauerstoff und Glukose im betroffenen Hirnareal kommt. Zellen im Zentrum des Infarktgebiets sterben sofort ab, während die Neuronen in der Umgebung (sog. Penumbra) abhängig von Signalen innerhalb der nächsten Stunden/Tagen, noch gerettet werden können. Die Pathophysiologie des Schlaganfalls umfasst sowohl hirnansässige als auch infiltrierende Zelltypen, die möglicherweise durch Übermittlung von Molekülen und Signalen via EV in enger Kommunikation miteinander stehen. In dieser Arbeit wurden EV aus Gehirnen von Mäusen mit experimentellem Schlaganfall (“tMCAO“), zusammen mit EV aus Hirnen von Kontrolltieren auf proteomischer und transkriptomischer Ebene analysiert. Wir stellten fest, dass kleine hirnabgeleitete EV (sBDEVs; Durchmesser ≤200 nm) von gesunden Mäusen mit ribosomalen Proteinen angereichert sind, während große BDEVs (≥200 nm) in Abhängigkeit von bestimmten Stoffwechselwegen mehr Proteine enthalten. Wir bestätigten die Anreicherung ribosomaler Proteine auch durch Analyse des Proteoms von BDEV mit unterschiedlichen Isolierungsprotokollen anderer Studien. Es zeigte sich, dass Mikrogliazellen unter physiologischen Bedingungen den größten Beitrag zum gesamten BDEV-Pool leisten. 24 Stunden nach Schlaganfall im Mausmodell ist die EV Freisetzung aus Astrozyten signifikant erhöht, was mit der glialen Narbenbildung, dem neuronalen Überleben oder der Aktivierung von Mikroglia zusammenhängen könnte. Im Gegensatz dazu besteht ein signifikanter Anstieg der aus Oligodrendrozyten stammenden EV 72 Stunden nach Schlaganfall. Unsere Analysen ergaben, dass 72 Stunden nach Schlaganfall isolierte BDEV mRNA enthalten, die mit Entzündungsreaktionen, Stressabwehr und Genesungsprozessen in Zusammenhang stehen und hauptsächlich von Mikroglia stammen. Des Weiteren konnten wir zeigen, dass die am stärksten hochregulierten mRNAs nach Schlaganfall in den EV in voller Länge vorhanden sind und daher in Empfängerzellen translatierbar wären. Wie EV die Zielzelle erreichen und wie (z.B. Fusion mit Plasmamembran oder endozytotische Aufnahme) sie ihre Ladung übertragen, ist noch unklar. Wir konnten zeigen, dass die Anwesenheit des Prionproteins (PrP) auf der Oberfläche von BDEV deren Aufnahme durch die Zielzellen deutlich beeinflusst. Da 24 Stunden nach Schlaganfall PrP auf BDEV signifikant erhöht ist, stellten wir die Hypothese auf, dass es eine wichtige modulatorische Rolle bei der Aufnahme durch, bzw. Fusion mit den Empfängerzellen und somit auch der Progredienz des Schlaganfalles spielt. Schließlich haben wir gezeigt, dass aktivierte humane CD8 T-Zellen EV freisetzen, die das Protein CD73 enthalten, welches AMPase-Aktivität besitzt und ATP abbauen kann. Diese purinerge Signalkaskade ist von hoher Bedeutung für die Immunregulation bei Entzündungen und Ischämie, bei denen der Gehalt an extrazellulärem ATP kritisch ist und EV für dessen Abbau eine zentrale Rolle zu spielen scheinen.