PITX2-Knockout in atrialem Engineered Heart Tissue zeigt ähnliche elektrophysiologische Veränderungen wie bei persistierendem Vorhofflimmern

Abstract

Hintergrund: Vorhofflimmern (VHF) ist die häufigste kardiale Arrhythmie des Menschen. Aufgrund der hohen kardiovaskulären Morbidität und Mortalität von Patienten mit VHF ist besonders die Entstehung von VHF Gegenstand aktueller Forschung. Neben ursächlichen kardiovaskulären Erkrankungen spielen auch genetische Faktoren bei der Entstehung von VHF eine entscheidende Rolle. In den „Genome-wide association studies“ zeigt sich eine starke Assoziation zwischen Genvarianten in der Nähe des PITX2-Gens („Paired-like homeodomain transcription factor 2“) und VHF. Verringerte PITX2-Konzentrationen im linken Vorhof werden als Ursache für diese Assoziation angenommen. Bis heute bleibt es jedoch unklar, wie verringerte PITX2-Konzentrationen zur Entstehung von VHF beitragen können. In dieser Arbeit sollen die Auswirkungen einer vollständigen PITX2-Deletion in humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSC), in aus hiPSC differenzierten atrialen Kardiomyozyten (hiPSC-aCM) und atrialem „Engineered Heart Tissue“ (aEHT) untersucht werden. Methoden: Der Protein-kodierende Anteil des PITX2-Gens wurde mittels CRISPR/Cas9 aus einer gesunden Kontrollzelllinie entfernt, sodass eine PITX2-defiziente hiPSC-Linie (PITX2-/-) entstand. Die Kontrollzelllinie (isogene Kontrolle) und die PITX2-/--hiPSC wurden durch ein Retinolsäure (RA)-enthaltendes Differenzierungsprotokoll zu hiPSC-aCM differenziert und in aEHT kultiviert. Es erfolgte die Messung von Kraft, Kontraktilität und Aktionspotenzialen (AP) in aEHT und Patch- Clamp in einzelnen hiPSC-aCM. Die Expressionsanalyse wurde mittels quantitativer PCR (qPCR) und RNA-Sequenzierung durchgeführt. Ergebnisse: PITX2-/--aEHTs zeigten eine geringere Kontraktionskraft und eine verringerte Expression (CACNA1C) und Stromdichte des L-Typ-Calciumstroms (LTCC, ICa,L). Darüber hinaus zeigten PITX2-/--aEHTs eine schwächere frühe Repolarisation und ein stärker negatives maximales diastolisches Potenzial (MDP). Die isogenen Kontroll-aEHTs zeigten eine starke initiale Repolarisation gefolgt von einer stark ausgeprägten Plateauphase. Darüber hinaus zeigten sie eine ähnliche Antwort auf den Block des Vorhof-spezifischen Kanals IKur (mit 4-Aminopyridin) und ähnliche muskarinerge Effekte (mit Carbachol) wie intaktes humanes Vorhofgewebe. Schlussfolgerung: Isogene Kontroll-aEHTs zeigen wichtige elektrophysiologische Charakteristika des menschlichen V orhofs und stellen eine V erbesserung bei der Entwicklung von elektrophysiologischen Vorhofmodellen dar. Atriale EHTs mit vollständiger PITX2-Defizienz zeigen elektrophysiologische Veränderungen, die sehr ähnlich sind zum elektrischen „Remodeling“ bei persistierendem VHF. Somit könnten verringerte PITX2-Konzentrationen elektrophysiologische Veränderungen verursachen, die ähnlich sind zu denen bei persistierendem VHF, jedoch in Abwesenheit von schneller elektrischer Aktivierung.