Quantitative trait locus (QTL) analysis of ash dieback in Fraxinus excelsior

Abstract

Ash dieback, caused by Hymenoscyphus fraxineus, threatens common ash (Fraxinus excelsior) across Europe. It leads to a severe increase in the mortality rate and losses in natural stands. Multiple studies have shown that susceptibility is a heritable trait and that genotypes with low susceptibility exist. Resistance genes often underlie larger genomic patterns that must be identified to understand the susceptibility mechanism within the tree fully. This thesis aims to investigate the genomic basis of ash dieback susceptibility, attempting to support genetic and genomic conservation strategies for F. excelsior. To achieve this, the identification and genotyping of full-sibling families within four progenies from potentially tolerant mother trees have been conducted. Using SSR markers and the COLONY program, full-sibling families were predicted and subjected to high-resolution genotyping with genome-wide SNP markers. This approach identified five large families suitable for genetic linkage mapping and quantitative trait locus (QTL) analyses. Further, the focus was on constructing high-density genetic linkage maps from the full-sibling families using the SNP markers and the Lep-MAP3 program. These maps were compared with the chromosome-level reference genome assembly and revealed high collinearity and notable differences, such as the split in chromosome 2 and the merging of chromosomes 22 and 23. Moreover, individual structural variants were predicted. These findings underscore the utility of genetic mapping in enhancing reference genome assemblies. To investigate the genomic basis of ash dieback and potentially connected genes, the genetic linkage maps were applied in a genome-wide QTL analysis on pseudo-backcross full-sibling families to identify loci associated with stem collar necrosis (SCN) as a key phenotype. One QTL for SCN was identified, explaining 15% of the phenotypic variance and highlighting the polygenic nature of susceptibility. Additionally, with the QTL locus range, a gene encoding protein PADRE domain-containing protein connected to fungus response was annotated. To obtain a higher resolution of the genetic map, verify the predicted structural variants and establish a pan-genome of F. excelsior for future association studies, long-read sequencing is essential. High-molecular-weight DNA is the key to achieve long-read sequencing. A protocol for extracting high-molecular-weight DNA from F. excelsior was developed for this. Based on nuclei isolation and DNA extraction using the Nanobind® plant nuclei kit by Pacific Biosciences, this protocol yielded high-quality DNA suitable for Oxford Nanopore Technologies and PacBio sequencing. The study underscores the complexities and adaptations required for successful high-molecular-weight DNA extraction in tree species.

Das Eschentriebsterben, verursacht durch Hymenoscyphus fraxineus, bedroht die Gemeine Esche (Fraxinus excelsior) in ganz Europa. Dies führt zu einem starken Anstieg der Sterblichkeitsrate und Verlusten in natürlichen Beständen und städtischen Räumen. Zahlreiche Studien haben gezeigt, dass die Anfälligkeit eine erblich bedingte Eigenschaft ist und dass Genotypen mit geringer Anfälligkeit existieren. Resistenzgene liegen oft größeren genomischen Mustern zugrunde, die identifiziert werden müssen, um den Anfälligkeitsmechanismus im Baum vollständig zu verstehen. In dieser Dissertation wird die genomische Grundlage der Anfälligkeit für das Eschentriebsterben untersucht, um genetische und genomische Naturschutz- und Erhaltungsstrategien für F. excelsior zu unterstützen. Zu diesem Zweck wurden die Identifizierung und Genotypisierung von Vollgeschwisterfamilien innerhalb von vier Nachkommenschaften potenziell toleranter Mutterbäume durchgeführt. Mit Hilfe von SSR-Markern und dem Programm COLONY wurden Vollgeschwisterfamilien vorhergesagt und einer hochauflösenden Genotypisierung mit SNP-Markern unterzogen. Die in diesem Ansatz identifizierten vier Familien, eigenen sich für die genetische Kopplungskartierung und die Analyse quantitativer Merkmale (QTL). Weiterhin lag der Fokus auf der Erstellung genetischer Kopplungskarten aus den Vollgeschwisterfamilien unter Verwendung der genomweiten SNP-Marker und des Programms Lep-MAP3. Diese Karten wurden mit der Chromosomen-Referenzgenomassemblierung verglichen und zeigten eine hohe Kollinearität sowie bemerkenswerte Unterschiede, wie die Teilung von Chromosom 2 und die Zusammenführung der Chromosomen 22 und 23. Zudem wurden individuelle strukturelle Varianten ermittelt. Diese Ergebnisse unterstreichen den Nutzen von genetischen Kartierung zur Verbesserung der Referenzgenomassemblierungen und tragen zum Verständnis der genomischen Basis der Anfälligkeit für das Eschentriebsterben bei. Um die genomische Basis und potenziell gekoppelte Gene der Anfälligkeit von Eschentriebsterben, wurden genetischen Kopplunktskarten in einer genomweiten QTL-Analyse an ‚pseudo-backcross‘ Vollgeschwisterfamilien angewandt. Hierdurch können Loci, die im Zusammenhang mit dem Stammfußnekrosen (SCN) stehen, bestimmt werden. Ein QTL für SCN wurde identifiziert, der 15% der phänotypischen Varianz erklärt und die polygenetische Natur der Anfälligkeit hervorhebt. Zusätzlich wurde im Bereich des QTL-Locus ein Gen annotiert, das ein Protein mit einer PADRE-Domäne kodiert, das mit der Pilzabwehr in Verbindung steht. Um eine höhere Auflösung der genetischen Karte und der strukturellen Varianten des Genoms zu erreichen und ein Pan-Genom für F. excelsior für zukünftige Studien zur Verfügung zu stellen, ist Long-Read-Sequenzierung unerlässlich. Hochmolekulare DNA ist der Schlüssel zu Long-Read-Sequenzierung. Ein Protokoll zur Extraktion hochmolekularer DNA aus F. excelsior wurde hierfür entwickelt. Das Protokoll basiert auf Zellkern Isolierung und der DNA-Extraktion mit dem Nanobind® Plant Nuclei Kit von Pacific Biosciences. Das Ergebnis ist DNA von hoher Qualität, die für die Sequenzierung mit Oxford Nanopore Technologies und PacBio geeignet ist. Die Studie unterstreicht die Komplexität und notwendige Anpassungen, die für eine erfolgreiche Extraktion hochmolekularer DNA bei unterschiedlichen Baumarten erforderlich sind.