Identifizierung gering konzentrierter diagnostischer Glykoproteine in humanem Plasma mittels Affinitäts-Chromatographie und Massenspektrometrie

Abstract

Das Ziel der vorliegenden Dissertation war die Entwicklung eines empfindlichen Verfahrens, das es ermöglichen soll, gering konzentrierte diagnostisch relevante Glykoproteine in humanem Plasma zu identifizieren, ohne dass deren Identität im Vorhinein bekannt ist. Hierfür wurden zwei affinitätschromatographische Schritte miteinander kombiniert. Zunächst wurde eine Anreicherung der im Plasma vorhandenen Glykoproteine aus einem Pool gesunder Kontrollpersonen über eine Wheat Germ Agglutinin (WGA) Affinitäts Chromatographie vorgenommen. Durch die Lektinfraktionierung des humanen Plasmas konnten ca. 96 % der gesamten Plasmaproteinmenge abgetrennt werden. Um die Analyse gering konzentrierter Plasmaproteine in der WGA gebundenen Fraktion zu ermöglichen, war eine selektive Abtrennung von regulär vorkommenden Proteinen der Glykoproteinfraktion erforderlich. Die WGA gebundene Plasmaproteinfraktion Gesunder wurde für die Immunisierung eines Lamas eingesetzt, um hochspezifische Antikörper gegen die Glykoproteine des Normalplasmas zu erhalten. Cameliden (Kamele und Lamas) bilden neben konventionellen Antikörpern eine besondere Form von Antikörpern, bei denen die leichte Kette und die CH1 Domäne deletiert sind. Diese sogenannten Schwerketten Antikörper besitzen im Vergleich zu konventionellen Antikörpern eine höhere chemische und thermische Stabilität. Durch die gerichtete Immobilisierung der Schwerketten Antikörper an eine Hydrazidmatrix wurde ein Immunabsorbens mit hoher Stabilität hergestellt, das bis zu 98 % der WGA gebundenen Plasmaproteine binden konnte. Da die Cameliden Antikörper nur gegen Glykoproteine gerichtet sind, die in Normalplasma vorkommen, sollten Proteine, die die WGA gebundene Proteinfraktion aus Normalplasma nicht enthält, nicht gebunden werden. Um diese Hypothese zu überprüfen, wurde ein glykosyliertes Testprotein eingesetzt, das Carcinoembryonale Antigen (CEA), das im Plasma Gesunder nur in sehr geringen Mengen vorkommt, dessen Plasmakonzentration jedoch beim Kolonkarzinom stark erhöht ist. Ein Plasmapool aus gesunden Kontrollpersonen wurde mit CEA (20 pmol/ml) versetzt, die WGA gebundene Glykoproteinfraktion isoliert und eine Abreicherung der Proteine des Normalplasmas mit der im Rahmen dieser Arbeit entwickelten Matrix aus immobilisierten Cameliden-Schwerketten-Antikörpern durchgeführt. Hierbei wurde das CEA nicht signifikant vom Immunabsorbens gebunden. Im Durchlauf der Immun Affinitäts Chromatographie konnte das CEA mittels einer LC MSE Analyse detektiert werden. Anschließend wurden die WGA gebundenen Plasmaproteinfraktionen von zwei Kolonkarzinompatienten über das Immunabsorbens aufgearbeitet. Auch in diesem Fall konnte das CEA im Durchlauf der Affinitäts Säule angereichert und mittels der LC MSE Analyse detektiert werden. Durch den Einsatz derartiger Affinitäts Säulen eröffnet sich daher die Möglichkeit, durch die Abreicherung der im Plasma Gesunder regulär vorkommender Glykoproteine eine entsprechende Anreicherung von diagnostich relevanten gering konzentrierten Markerproteinen zu erreichen. In jedem Fall muss das diagnostisch relevante Glykoprotein Glykanreste tragen, die eine spezifische Bindung zum Lektin erlauben und in der angereicherten Glykoproteinfraktion mit einer Konzentration grösser 20 pmol/ml vorkommen.

The identification and quantification of characteristic changes in the plasma proteome can potentially be helpful in early diagnosis of a disease and monitoring of a therapy. Due to the enormous complexity and the biological heterogeneity of the human plasma proteome, the discovery of biomarkers in the low concentration range of plasma requires the depletion of highly abundant proteins. Therefore, for the detection of minor components fractionation is always required. Here we report on a tandem affinity strategy for the identification of low abundant glycosylated protein biomarkers of human plasma: In the first step we isolated a glycosubproteome of the human plasma by wheat germ agglutinin (WGA) lectin affinity chromatography. In the second step, the proteins of this subproteome were used to raise antibodies in llama (Lama glama). The heavy chain fraction of the llama antibodies was used to deplete from the WGA lectin binding fraction all proteins normally found in human plasma. In this way we selectively enriched proteins specific for a pathological state. As a proof of concept we applied this method to the analysis of plasma samples from colon cancer patients. We could demonstrate the selective enrichment of the cancer marker CEA by a factor of 600-800. For the identification and label-free quantification of the proteins isolated by this strategy electrospray QTOF LC/MS mass spectrometry was applied, using the data-independent MSE technique.