Expression und Charakterisierung der rezeptorbindenden Domäne des Influenza A H5N1 Virus

Abstract

Ziel der Arbeit war die Charakterisierung und Expression der rezeptorbindenden Domäne der Influenza A H5N1 Virus sowie der Einsatz als kompetitiver Hemmstoff in der Influenzazellkultur. Die Charakterisierung erfolgte mit Hilfe von computerbasierten 3 D Rekonstruktionen des Virus. Anhand dieser wurde die Rezeptorstruktur des Hämagglutins HA 5 ermittelt und eine Strategie für das zu exprimierende Protein festgelegt. Nach Klonierung in einen bakteriellen Vektor erfolgte die Proteinexpression durch ein T-7 Promotor gesteuertes E.coli System. Nach Ermittlung der optimalen Expressionsbedingungen wurden verschiedene Vektoren verwendet sowie unterschiedliche Aufreinigungsverfahren für Proteine angewendet. Die Schwierigkeit lag dabei an der Bildung von intrazellulären Proteinaggregaten, wodurch sich dieses nicht auf nativem Wege aufreinigen ließ. Im Verlauf wurde eine Zelllyse mit Guanidinhydrochlorid mit anschließend renaturierender Proteinaufreinigung als vorteilhafteste Methode ermittelt. Das exprimierte Protein wurde quantifiziert und anhand von Western Blots als antigene Domäne des Hämagglutinins nachgewiesen. In einem zweiten Teil wurde ein Viruszellkultursystem für aviäre Influenzaviren aufgebaut. Ziel dessen war die Untersuchung des rekombinant hergestellten Hämagglutinins hinsichtlich einer kompetitiven Hemmung auf die Influenza-Virusreplikation. Zusätzlich wurde die Spezifität der Hemmung auf Influenza-A Subtypen untersucht. Eine MDCK-Zellkultur und die Standardisierung der Viruszellkultur für die beiden hochpathogenen Influenzaviren H5N1 und H7N7 wurden etabliert. Eine Quantifizierung mittels Plaque-Assay und Real-Time PCR gegen Influenza A Viren wurden angeschlossen. Eine kompetitive Hemmung des Viruswachstums von H5N1 durch Zugabe von rekombinant hergestelltem H5 konnte gezeigt werden. Dieser Effekt lies sich bereits durch eine Präinkubation mit H5 zeigen, welcher sich allerdings nach einem Tag aufhob. Beließ man rekombinantes H5 im Infektionsmedium, ließ sich das Viruswachstum bereits ab einer Konzentration von 1 μg H5 dauerhaft hemmen. Auf das Viruswachstum von H7N7 hatte die Zugabe von rekombinantem H5 keinen wesentlichen Effekt. Die Inhibition des Viruswachstums des hergestellten H5 Proteins war somit spezifisch für H5N1.