Effect of macromolecular mass transport in microgravity vs 1G protein crystallization

Abstract

To investigate the effect of macromolecular transport and the incorporation of protein aggregate impurities in growing crystals, experiments were performed on the International Space Station (ISS) and compared with control experiments perform in a 1G laboratory environment. Crystal growth experiments for hen egg lysozyme (HEWL) and Plasmodium falciparum Glutathione S-Transferase (PfGST) were monitored using the ISS Light Microscopy Module (LMM). Crystallization solutions containing different protein-aggregate ratios were prepared. Experiments were performed applying the liquid-liquid counter diffusion crystallization method using rectangular, optically transparent capillaries. The crystallization samples were launched to the ISS via SpaceX-10 and SpaceX-15 missions. Three series of crystallization experiments were performed on ISS, one during 26.02.2017 until 10.03.2017, second during 16.06.2017 until 23.06.2017 (both Biophysics 1) and a third during 12.07.2018 until 24.07.2018 (Biophysics 4). A comparison of crystal growth rates and size showed different calculated average growth rates, as well different dimensions for crystals growing in different positions along the capillary. The effect of macromolecular mass transport on crystal growth in microgravity was experimentally investigated. For the crystallization samples with similar start conditions for both 1G and μg, assuming optimal crystallization conditions, the diffusion-controlled mass transport and thus the slower crystal growth in μg led to the growth of larger crystals. The experiments indicate that the growth of crystals with different dimensions in different areas of the capillary were successful for different time periods. Furthermore, for the growth of crystals with similar dimensions, the crystals grown in 1G started prior to the crystals grown in μg. In parallel, the percentage of incorporated fluorescent aggregate into the crystals was monitored utilizing the fluorescent Light Microscopy Module (LMM) and ground-based fluorescent microscopes. The observed microscopic and measured intensity data indicated that the crystals incorporated notable quantities of fluorescently labelled impurities. Thus, the effect of impurity in protein crystallization on the quality of crystals grown in 1G and μg in the context of the counter-diffusion method could be investigated. The crystals with higher amounts of incorporated impurities had substantially decreased signal-to-noise and increased mosaicity values. Consequently, purifying the crystallization solutions to the highest level possible could increase the possibility of obtaining crystals with improved quality. The results of the diffraction data indicated that diffusion-limited mass transport in crystallization can be beneficial for the quality of growing crystals. The statistical analysis of diffraction data indicated a fairly strong relationship between the crystal quality parameter values for both 1G and μg crystals. The hydrodynamic radii of three different proteins in capillary samples were determined using a multichannel DLS system. Furthermore, the crystallization process of a PfGST sample were observed using multichannel DLS system. The observations confirm that the technique for the investigation of protein crystallization in fluid systems using a multichannel DLS system is appropriate.

Um den Effekt des makromolekularen Transports und damit auch den Einbau von Proteinverunreinigungen in wachsende Protein Kristalle zu untersuchen, wurden Experimente auf der Internationalen Raumstation (ISS) durchgeführt und mit Kontrollexperimenten auf der Erde verglichen, Zu diesem Zweck wurden Hühnerei-Lysozym (HEWL) und Plasmodium falciparum Glutathion-S-Transferase (PfGST) ausgewählt. Kristallwachstum wurde unter Verwendung des ISS–Lichtmikroskopiemoduls überwacht und dokumentiert. Kristallisationsansätze mit unterschiedlichen Protein-Verunreinigungs-Verhältnissen wurden hergestellt. Die Experimente wurden mit der Counter – Diffusions-Methode unter Verwendung von rechteckigen, optisch transparenten Kapillaren durchgeführt. Die Kristallisationsproben wurden mit SpaceX-10- und SpaceX-15-Missionen zur ISS gebracht. Drei Reihen von Kristallisationsexperimenten wurden auf der ISS durchgeführt, eine vom 26.02.2017 bis 10.03.2017, eine zweite vom 16.06.2017 bis 23.06.2017 (beide Biophysik 1) und eine dritte vom 12.07.2018 bis 24.07.2018 (Biophysik 4). Ein Vergleich der Kristallwachstumsrate und auch der Größe ergab unterschiedliche berechnete, durchschnittliche Wachstumsraten sowie unterschiedliche Dimensionen für Kristalle, die an unterschiedlichen Positionen entlang der Kapillare wuchsen. Die Auswirkung des makromolekularen Massentransports auf das Kristallwachstum in den Mikrogravitätsbedingungen wurde experimentell berechnet. Bei den Kristallisationsproben mit ähnlichen Startbedingungen sowohl für 1G als auch für μg führte der diffusionskontrollierte Massentransport und damit das langsamere Kristallwachstum in μg bei optimalen Kristallisationsbedingungen zum Wachstum größerer Kristalle. Die Experimente zeigten, dass das Wachstum von Kristallen mit unterschiedlichen Dimensionen in verschiedenen Bereichen der Kapillare für verschiedene Zeiträume erfolgreich war. Das Wachstum von in 1G gewachsenen Kristallen mit ähnlichen Abmessungen im Unterschied zu den in μg gewachsenen Kristallen begann zu einem früheren Zeitpunkt. Parallel dazu wurde der Prozentsatz der in die Kristalle eingebauten fluoreszierenden Aggregate unter Verwendung des Lichtmikroskopiemoduls (LMM) und bodenbasierter Mikroskope ermittelt. Die absolvierten mikroskopischen Bilder und gemessenen Intensitätsdaten zeigten, dass die Kristalle bemerkenswerte Mengen fluoreszenzmarkierter Verunreinigungen enthielten. So konnte der Einfluss von Verunreinigungen bei der Proteinkristallisation auf die Qualität von in 1G und μg gewachsenen Kristallen im Rahmen der angewendeten Methode untersucht werden. Die Kristalle mit höheren Mengen an eingebauten Verunreinigungen hatten ein wesentlich geringeres Signal-Rausch-Verhältnis und erhöhte Mosaizitätswerte. Folglich kann die Reinigung der Kristallisationslösungen auf das höchstmögliche Niveau die Möglichkeit erhöhen Kristalle mit verbesserter Qualität zu erhalten. Die Ergebnisse der Beugungsdaten zeigten, dass nur der diffusionsgeführte Massentransport bei der Kristallisation für die Qualität wachsender Kristalle vorteilhaft sein kann. Die statistische Analyse der Beugungsdaten zeigte eine ziemlich starke Beziehung zwischen den Kristallqualitätsparametern sowohl für 1G als auch für μg Kristalle. Der hydrodynamische Radius von drei verschiedenen Proteinen in Kapillarproben wurde unter Verwendung eines Mehrkanal-DLS-Systems bestimmt. Weiterhin wurde die Kristallisation einer PfGST-Probe unter Verwendung eines Mehrkanal-DLS-Systems beobachtet. Die Beobachtungen bestätigen, dass die Technik zur Untersuchung der Proteinkristallisation in Fluidsystemen geeignet ist.