Advanced fiber-optic ultrafast laser sources for multiphoton microscopy

Abstract

Multiphotonen-Mikroskopie (MPM) ist eine der wichtigsten Anwendungen von Ultrakurzpuls-Lasern und ein leistungsfähiges Werkzeug für die biomedizinische Bildgebung. Die Essenz von MPM beruht auf der Wechselwirkung zwischen den ultraschnellen Laserimpulsen und der Probe, die auf unterschiedlichen Mechanismen beruht. Herkömmlicherweise wird MPM hauptsächlich mittels Festkörperlasern betrieben, z. B. Ti:Saphir-Laser plus einen synchron gepumpten optischen parametrischen Oszillator (OPO), die bei einigen-zehn-MHz Pulswiederholrate betrieben werden, Impulse mit etwa 10-nJ Impulsenergie und etwa 100-fs Impulsdauer erzeugen, und eine bestimmte Wellenlängenabstimmbarkeit besitzen. Diese Festkörperlösungen sind jedoch sperrig, benötigen Wasserkühlung, sind empfindlich gegenüber Umweltschwankungen und teuer, welches die weitere Verbreitung von MPM in biologischen Studien und in der klinischen Anwendung begrenzt. Trotz der begrenzten Emissionswellenlänge sind faserbasierte Ultrakurzpulslaser, die Robustheit, Kompaktheit und kosteneffektives Merkmal aufweisen, in letzter Zeit zu einer potentiellen Alternative zum Antreiben von MPM geworden. Durch den Einsatz verschiedener nichtlinearer faseroptischer Methoden können neue Spektren für MPM erzeugt werden. Vor kurzem haben wir einen neuen Ansatz demonstriert, um weit abstimmbare hochenergetische Impulse für eine solche Anwendung zu erreichen. Das Verfahren—durch Selbstphasenmodulation Spektralselektion (SESS)—verwendet eine von der Selbstphasenmodulation (SPM) dominierte spektrale Verbreiterung in der optischen Faser, gefolgt von einer Filterung der am weitesten links oder der am weitesten rechts liegenden spektralen Keulen der daraus resultierenden Spektren. Zum Beispiel ermöglicht die Verwendung eines Yb-dotierten Faserlasers (YDFL), der bei 1030 nm als Pumpquelle zentriert ist, SESS zur Erzeugung von nahezu transform-limitierten Impulsen, die von 825 nm bis 1210 nm abstimmbar sind. Das resultierende Spektrum ist vergleichbar mit dem von Ti: Saphir-Lasern und unterstützt die Zwei-Photonen-Fluoreszenz (2PEF) vieler wichtiger Fluorophore und die harmonische Generationsmikroskopie (HGM), einschließlich Frequenzverdopplung (SHG) und Frequenzverdreifachung (THG). Inspiriert durch den Erfolg von SESS mit 1-μm YDFLs erforschen wir hier die weitere Wellenlängenabdeckung, die mittels anderer faserbasierter SESS-Quellen möglich ist. In dieser Doktorarbeit implementieren wir SESS basierend auf einem selbst gebauten Er-dotierten Faserlaser (EDFL), der bei 1,55 μm zentriert ist—eine einzigartige Wellenlänge genau zwischen zwei wichtigen biologischen Transmissionsfenstern bei 1,3 μm und 1,7 μm für die Tiefengewebe-Bildgebung. Wir untersuchen numerisch und experimentell SESS, das optische Fasern mit unterschiedlicher Dispersion benutzt. Mit einer 31-MHz-EDFL-Pumpquelle, die Pulse mit 160 nJ Pulsenergie und 290 fs Pulsdauer erzeugt, kann SESS zu Pulsen führen, die abstimmbar zwischen 1,15 μm und 1,7 μm sind, >15 nJ Pulsenergie und Pulsdauern kürzer als 100 fs haben. Wir zeigen auch, dass SESS in optischen Fasern mit anomaler Dispersion machbar ist, in denen die spektrale Verbreiterung immer noch durch den SPM-Effekt dominiert wird und durch Soliton-Kompression höherer Ordnung begünstigt wird, solange man Soliton-Spaltung vermeidet. SESS weist eine herausragende Energie-Skalierbarkeit auf. Mit einer μJ-Pumpquelle kann man Femtosekundenpulse bei 1,3 μm oder 1,7 μm mit einer Pulsenergie von mehr als 100 nJ erreichen, was einer Pulsspitzenleistung im MW-Bereich entspricht. Wir integrieren diese EDFL-basierte SESS-Quelle mit einem Scanning-Mikroskop und demonstrieren ihre Anwendung für MPM. Zum Beispiel führen wir eine optische virtuelle Biopsie der menschlichen Haut durch, die durch HGM aktiviert wird, und Femtosekundenimpulse bei 1,25 μm verwendet. Wir untersuchen auch den Einfluß der Anregungswellenlänge im Transmissionsfenster von 1,15-1,35 μm auf die resultierende HGM-Bildgebung. Herkömmlicherweise werden in diesem Wellenlängenbereich Festkörper-OPOs oder Cr:Forsterit-Laser benutzt. Durch die Frequenzverdopplung eines Teils des Pumpstrahls auf 775 nm bildet der EDFL eine zweifarbige ultraschnelle Quelle, die ein multimodales MPM ermöglicht. Neben HGM, das in der menschlichen Haut demonstriert wurde, steht 2PEF aus den intrinsischen Fluorophoren unter 775-nm Anregung zur Verfügung, was 3-Kanal (SHG, THG und 2PEF) markierungsfreie Hautbildgebung ermöglicht. Es ist bemerkenswert, dass eine 775-nm Anregung zu einer Drei-Photonen-Fluoreszenz (3PEF) von den aminoaromatischen Säuren des Proteins führen kann. Durch die Kombination mit SHG ermöglicht die SHG/3PEF-Modalität die Erkennung und Unterscheidung von Proteinkristallen und Salzkristallen. Zusammenfassend demonstrieren wir eine EDFL-basierte ultraschnelle Quelle, die nichtlineare Faseroptiken nutzt und breit abstimmbare Femtosekundenpulse für vielseitige MPM ermöglicht. Eine solche faserbasierte Quelle stellt eine robuste und kostengünstige Alternative zu Festkörperlasern dar und ist für klinische Anwendungen geeignet.

As a powerful tool for bio-imaging, multiphoton microscopy (MPM) integrates two advanced technologies—ultrafast lasers and scanning microscope. The essence of MPM relies on the nonlinear interactions between ultrafast pulses and samples. Conventionally, the burden to drive MPM mainly falls on solid-state mode-locked lasers, e.g., Ti:sapphire lasers plus synchronously pumped optical parametric oscillators (OPOs), which operate at tens of MHz and generate 100-fs pulses with 10-nJ pulse energy. However, these expensive solid-state solutions are bulky and sensitive to environmental fluctuations, and demand water cooling, which limit their further prevalence in biomedical applications. Despite the limited emission wavelength, ultrafast fiber lasers exhibit robustness, compactness, and cost-effectiveness, which make them a potential alternative to driving MPM. Together with nonlinear fiber-optic wavelength conversion, femtosecond pulses at new wavelength can be readily generated for MPM. Recently, we demonstrated a new approach to achieve widely tunable energetic pulses desired by MPM applications. The method—self-phase modulation enabled spectral selection (SESS)—employs self-phase modulation (SPM) dominated spectral broadening in optical fibers to broaden an input narrowband spectrum. The broadened spectrum features well-isolated spectral lobes; filtering the leftmost or the rightmost spectral lobes results in nearly transform-limited pulses. For example, SESS based on an Yb-doped fiber laser (YDFL) centered at 1030 nm, allows us to generate 100-fs pulses tunable from 825 nm to 1210 nm. The resulting spectrum supports driving two-photon excitation fluorescence (2PEF) of many important fluorophores and harmonic generation microscopy (HGM) including second-harmonic generation (SHG) and third-harmonic generation (THG). Inspired by the success of SESS enabled by 1-μm YDFLs, we further explored the wavelength coverage allowed by other fiber-based SESS sources. In this thesis, we implemented SESS based on a home-built Er-doped fiber laser (EDFL) centered at 1.55 μm—a unique wavelength right between two important biological transmission windows at 1.3 μm and 1.7 μm for deep-tissue imaging. We numerically and experimentally investigated SESS operating in optical fibers exhibiting different dispersions. With a 31-MHz EDFL emitting 160-nJ, 290-fs pulses, SESS generated 100-fs pulses widely tunable between 1.15 μm and 1.7 μm with up to >15-nJ pulse energy. We also demonstrated that SESS is feasible in optical fibers with anomalous dispersion, in which the spectral broadening is still dominated by SPM and one benefits from higher-order soliton compression, as long as one stays away from soliton fission. SESS exhibits outstanding energy scalability. With a μJ pump source, one can achieve femtosecond pulses at 1.3 μm or 1.7 μm with pulse energies exceeding 100 nJ, corresponding to a pulse peak power at the MW level. We integrated this EDFL-based SESS source with a scanning microscope and demonstrated various MPM applications. For example, we conducted optical virtual biopsy in human skin enabled by HGM excited by 1.25-μm femtosecond pulses. We also investigated the effect of excitation wavelength within the transmission window of 1.15-1.35 μm on the resulting HGM imaging. Conventionally, the wavelength coverage is provided by solid-state OPOs or Cr:forsterite lasers. By frequency doubling part of the beam to 775 nm, the EDFL constitutes a two-color ultrafast source enabling multimodal MPM. Besides HGM demonstrated in human skin, 2PEF from the intrinsic fluorophores is available under 775-nm excitation, which allows 3-channel (SHG, THG, and 2PEF) label-free skin imaging. It is noteworthy that 775-nm excitation can also lead to three-photon excitation fluorescence (3PEF) from the amino aromatic acids of proteins. Combining with SHG together, the SHG/3PEF modality enabled us to detect and distinguish protein crystals from salt crystals. In conclusion, we demonstrate an EDFL-based ultrafast source harnessing nonlinear fiber-optics enabling widely tunable femtosecond pulses for versatile MPM. Such a fiber-based source constitutes an alternative to solid-state lasers and has a great potential for clinical applications.