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Titel: Analysen des Adaptorprotein-abhängigen Transports des lysosomalen Membranproteins CLN7 und von Mausmodellen (Mus musculus) der CLN7-Erkrankung
Sonstige Titel: Analysis of adaptor protein dependent trafficking of the lysosomal membrane protein CLN7 and of mouse models (mus musculus) for CLN7 disease
Sprache: Deutsch
Autor*in: Brandenstein, Laura Isabel
Erscheinungsdatum: 2015
Tag der mündlichen Prüfung: 2015-12-11
Zusammenfassung: 
Die CLN7-Erkrankung ist eine neurodegenerative, autosomal-rezessiv vererbte lysosomale Speichererkrankung, die durch Defekte im MFSD8/CLN7-Gen verursacht wird. Das CLN7-Membranglykoprotein ist ein lysosomaler MFS-Transporter mit unbekanntem Substrat. In dieser Arbeit wurden durch Deletion des Exon 2 des murinen Mfsd8/Cln7-Gens zwei Mausmodelle für die CLN7-Erkrankung generiert: eine Cln7 lacZ Gene-trap (Cln7 (tm1a/tm1a)) Maus und eine Cln7 knockout (Cln7 (-/-)) Maus. Mit Hilfe dieser Mausmodelle wurden der Beginn und die altersabhängige Progression neurodegenerativer, morphologischer und biochemischer Veränderungen im Gehirn, sowie die Beteiligung von Pathomechanismen bei der CLN7-Erkrankung analysiert.

- Analysen der β-Galaktosidase-Expression in der Cln7 (+/tm1a) Maus zeigten die stärkste Expression von Cln7 in Neuronen des Hippocampus und zerebralem Cortex
-es wurde ein polyklonaler anti-Cln7 Antikörper generiert, der das endogene Cln7 der Maus in Western-Blot-Analysen detektiert
-Western-Blot-Analysen von Tritosomen aus Lebergewebe zeigten, dass Cln7 ein integrales lysosomales Membranprotein ist
-die hypomorphen Cln7 (tm1a/tm1a) Mäuse rekapitulieren wichtige, aber nicht alle Merkmale der humanen CLN7-Erkrankung wie Speicherung von Scmas, Autofluoreszenz in Neuronen, Aktivierung von Astrozyten, und Degeneration von Photorezeptoren in der Retina
-phänotypische Analysen zeigten, dass die Cln7 (-/-) Mäuse ein geeignetes Modell zum Studium der CLN7-Erkrankung mit variant spät-infantilem Phänotyp darstellen
-bei den Cln7 (-/-) Mäusen wurden erhöhte Mortalität und neurologische und motorische Symptomatik im Endstadium der Erkrankung detektiert
-in der Retina von Cln7 (-/-) Mäusen wurde eine im Alter von einem Monat einsetzende, progredient fortschreitende Neurodegeneration von Photorezeptoren der äußeren Körnerschicht, Aktivierung von Astrozyten und Mikrogliazellen gefunden
-es wurden eine erhöhte Expression der löslichen lysosomalen Enzyme Cts Z, Cts D und Cts B im Gehirn der Cln7 (-/-) Mäuse gefunden
-die Cln7-Defizienz führt im Gehirn der Cln7 (-/-) Mäuse zur generalisierten Akkumulation von autofluoreszierendem Speichermaterial in Lysosomen, das aus Scmas und Saposin D zusammengesetzt ist und ultrastrukturell hauptsächlich kurvilineare Einlagerungen und vereinzelt fingerprint-Profile enthält
-im Gehirn der Cln7 (-/-) Mäuse waren verschiedene Pathomechanismen beteiligt, wie die Aktivierung neuroinflammatorischer Zellen, lysosomale Dysfunktion und Störungen der Makroautophagie
-MRT-Analysen von Cln7 (-/-) Mäusen zeigten Neurodegeneration im Riechkolben, im zerebralen und im cerebellären Cortex im Endstadium der Erkrankung

Für den signalabhängigen Transport von CLN7 zu Lysosomen sind ein dominantes N-terminales Di-Leucinmotiv und zwei C-terminale Tyrosinmotive wichtig.

-durch in vitro GST-Kopräzipitations-Experimente wurde eine Interaktion des N-terminalen Di-Leucinmotivs mit AP1 und AP2 verifiziert
-Oberflächen-Plasmonen-Resonanz-Analysen bestätigten die Interaktion der C-terminalen Tyrosinmotive mit μ1A und zeigten eine bisher nicht detektierte Interaktion mit μ2
-Fluoreszenz-basierte FACS-Analysen zeigten, dass CLN7 in AP1γ- und AP2α-knockdown Zellen an die Plasmamembran fehlsortiert wird.

CLN7 disease is an autosomal-recessively inherited lysosomal storage disorder that leads to neurodegeneration and is caused by defects in the MFSD8/CLN7 gene. CLN7 represents a lysosomal membrane glycoprotein and a MFS-transporter with unknown substrates. During this thesis, two mouse models for CLN7 disease were created by deleting exon 2 of the MFSD8/Cln7 gene: one Cln7 lacZ gene-trap (Cln7 (tm1a/tm1a)) and one Cln7 knockout (Cln7 (-/-)) mouse. The mouse models were used to analyze the age-dependent progression of neurodegenerative, morphological and biochemical alterations in the brain and the pathomechanisms of CLN7 disease.

-Analysis of β-galactosidase expression in Cln7 (+/tm1a) mice showed strongest Cln7 expression in neurons of the hippocampus and cerebral cortex
-a polyclonal anti-Cln7 antibody was generated detecting endogenous mouse Cln7 in western Blot analysis
-western blot analysis of liver tritosomes showed that Cln7 is an integral lysosomal membrane protein
-the hypomorphic Cln7 (tm1a/tm1a) mice recapitulated important, but not all features of human CLN7 disease such as storage of Scmas, autofluorescence in neurons, activation of astrocytes and degeneration of photoreceptors in the retina
-phenotypic analysis showed that Cln7 (-/-) mice are a useful model to study CLN7 disease with variant late-infantile phenotype
-Cln7 (-/-) mice showed increased mortality and neurological symptoms in end stage of the disease
-retinas of Cln7 (-/-) mice showed progressive neurodegeneration of photoreceptors in the outer nuclear layer and activation of astrocytes and microglia
-increased expression of the soluble lysosomal enzymes Cts Z, Cts D und Cts B were detected in the brain of Cln7 (-/-) mice
-Cln7 deficiency leads to accumulation of autofluorescent storage material in lysosomes of Cln7 (-/-) brains, which consists of Scmas and saposin d, presenting as curvilinear and fingerprint-profiles in electron microscopy
-different pathomechanisms lead to neurodegeneration in Cln7 (-/-) mice: activation of neuroinflammatory cells, lysosomal dysfunction and disturbed macroautophagy
-MRT-analysis of Cln7 (-/-) mice in the end stage of the disease showed neurodegeneration within the olfactory bulb, cortex and cerebellum

A dominant N-terminal di-leucine motif and two C-terminal tyrosine motifs are important for the trafficking of CLN7 to lysosomes.
-in vitro GST-co-precipitations verified the interaction between the N-terminal di-leucine motif with AP1 and AP2

- Surface plasmon resonance analysis verified the interaction of the C-terminal tyrosine motifs with µ1A and µ2
-Fluorescence-based FACS-analysis showed that CLN7 is missorted in AP1γ- and AP2α-knockdown cells
URL: https://ediss.sub.uni-hamburg.de/handle/ediss/6556
URN: urn:nbn:de:gbv:18-76561
Dokumenttyp: Dissertation
Betreuer*in: Hoth, Stefan (Prof. Dr.)
Enthalten in den Sammlungen:Elektronische Dissertationen und Habilitationen

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