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Titel: Development of protocols and workflows for a fast gene synthesis and de novo synthesis of viral genomes
Sonstige Titel: Entwicklung von Protokollen und Arbeitsabläufen für eine schnelle Gensynthese und de novo Synthese vitaler Genome
Sprache: Englisch
Autor*in: Weigl, Julia
Schlagwörter: Meerschweinchenadenovirus; Guinea-Pig-Adenovirus
Erscheinungsdatum: 2018
Tag der mündlichen Prüfung: 2018-12-05
Zusammenfassung: 
Synthetic biology became one of the most admired branches within new age technologies. The past 30 years brought innovations forth with high impact on medicine, ecology and technology. Indispensable in all areas is the production of synthetic DNA in large scales and high quality.
In this thesis, the first project was to optimize the established production pathway of gene synthesis on the basis of polymerase chain reactions (PCR) in time, to abridge the generating of desired genes. A set of various sequences from different origin and complexity ranging from 300 – 1500 bp in size with a moderate GC-content, was tested on the new developed protocols. A significant reduction of the turnaround time by 47% was achieved, keeping the reliability of correct constructs. The utilisation of the Plackett-Burman statistical tool afforded the effective determination of critical factors by an experimental set-up with a fractional factorial design. In this study, protocols were developed to serve the need of fast access to genetic material as for DNA vaccination against tumours.
The goal of the second project was the consecutive building of large DNA fragments of a wild type adenoviral sequence. The guinea pig adeno virus was found to be responsible for infectious outbreaks among laboratory guinea pig populations, leading to the severe disease bronchopneumonia of immunocomprised animals, ending in death of the infected animals. Histopathological investigations of the isolate GER1 occasioned to the generation of a complete in silico sequence of the genomic DNA. This sequence was the source material to develop synthesis protocols for challenging large constructs. The synthesis of the complete adenoviral genome in eight blocks was successfully performed and can be used for isolation and cultivation of the virus after transfection into guinea pig cells. Furthermore, an official annotation can now be conducted based on transcriptome analysis. In this thesis, eight blocks were built by using the capability of Saccharomyces cerevisiae to homologous recombination. With the Genome Partitioner tool a sufficient higher order assembly strategy was developed, which is applicable on the wild-type sequence. Due to long GC-peaks, allocated secondary structures and the multiple presence of common restriction sites other cloning strategies were found unsuitable. Adenoviruses inherit a specific inverted terminal repeat sequence (ITR) flanking both 5’ and 3’ terminal ends, that is responsible for integration into the host genome and initiation of replication. These ITRs interfere the complete assembly of a whole viral linear genome acting like overlapping sequences and may lead to mis-assembly. A sequence optimization of critical sequence areas might give the possibility to build even larger fragments and the whole genome. To avoid the recombination on the ITR sites, a vector can be plotted that already includes the ITR sequences. Thus the ITRs can be released by restriction digest connected to the remaining genomic sequence after integration into the target vector. Transfection of guinea pig tracheal cells (GPTEC-T) with the in vitro assembled whole construct did not lead to virus formation.
In this study though, the basis was created for deeper determinations on the viral genome and its infection mechanism. This establishment of a guinea pig adenovirus model can then answer further questions on the tumour formation that appears after infection of rodents with human adenoviruses and pathogenicity in the guinea pig host organism.

Synthetische Biologie wurde zu einer der renommiertesten Branchen unter den zeitgenössischen Technologien. Die letzten 30 Jahre brachten Innovationen hervor, die einen starken Einfluss auf Medizin, Ökologie und Technologie haben. Unverzichtbar in allen Bereichen ist dabei die Produktion synthetischer DNS in großem Maßstab und hoher Qualität. In dieser Arbeit befasste sich das erste Projekt mit der zeitlichen Optimierung des klassischen Produktionswegs der Gensynthese, der auf Polymerasekettenreaktion (PKR) basiert, um die Generierung der gewünschten Gene zu beschleunigen. Eine Zusammenstellung verschiedener Sequenzen unterschiedlichen Ursprungs und Komplexität, die zwischen 300 – 1500 bp lang waren und einen moderaten GC-Gehalt hatten, wurde mit den neu entwickelten Protokollen getestet. Eine signifikante Reduktion der Durchlaufzeit von 47% wurde erreicht, bei gleichbleibender Zuverlässigkeit der richtigen Konstrukte. Die Anwendung des Plackett-Burman statistischen Instruments erbrachte die effiziente Identifikation kritischer Faktoren, durch einen teilfaktoriellen Versuchsplan. In dieser Arbeit wurden Protokolle entwickelt, die das Erfordernis nach schnellem Zugang zu genetischem Material bedienen, wie bei der DNA Impfung gegen Tumore.
Ziel des zweiten Projektes war der konsekutive Bau großer DNS Fragmente einer wildtypischen, adenoviralen Sequenz. Der neu entdeckte Meerschweinchen-Adenovirus ist verantwortlich für infektiöse Krankheitsausbrüche unter Meerschweinchenpopulationen in Laboren, die zu einer schweren Erkrankung an Bronchopneumonie in immunschwachen Tieren führten und im Tod betroffener Tiere endeten. Histopathologische Untersuchungen der Isolates GER1 lieferten die in silico Sequenz der genomischen DNS. Diese Sequenz war das Ausgangsmaterial, um Syntheseprotokolle zu entwickeln, abgestimmt auf schwierige, große Konstrukte. Die Herstellung des Adenovirusgenoms in acht Blöcken war erfolgreich durchgeführt worden und kann nach Transfektion in Meerschweinchenzellen zu einer Isolierung und Kultivierung des Virus genutzt werden. Des Weiteren kann jetzt nach einer Transkriptomanalyse der Säugerzellen eine offizielle Annotation vorgenommen werden. In dieser Arbeit wurden die acht Blöcke unter Verwendung des Mechanismus der homologen Rekombination von Saccharomyces cerevisiae gebaut. Mit dem Genome-Partitioner-Tool wurde eine geeignete hierarchische Assemblierungsstrategie entworfen, die auf diese wildtypische Sequenz anwendbar ist. Durch lange GC-Strecken, verteilte Sekundärstrukturen und das mehrfache Vorhandensein gängiger Restriktionsschnittstellen waren andere Klonierungsstrategien ungeeignet. Adenoviren beinhalten in ihrer DNS Sequenz sogenannte invertierte terminale Repetitionen (ITR), die sowohl das 5‘-, als auch das 3‘-Ende flankieren, welche für die Integration in das Wirtsgenom und den Replikationsstart verantwortlich sind. Diese ITR behindern einen vollständigen Zusammenbau des viralen Genoms, da sie sich während der Rekombination wie überlappende Sequenzen verhalten und so zu einer Fehlassemblierung führen können. Eine Sequenzoptimierung kritischer Stellen kann einen Zusammenbau größerer Fragmente oder sogar des gesamten Genoms ermöglichen. Um eine Rekombination der ITR zu umgehen, kann ein Vektor entworfen werden, der die Sequenzen der ITR bereits enthält. Nach der Integration können diese, angebaut an die restliche genomische Sequenz, wieder durch Restriktionsverdau mit ausgeschnitten werden. Die Transfektion von Meerschweinchen-Trachea-Zellen mit dem in vitro zusammengebauten Volllängekonstrukt hat nicht zur Entstehung von Viren geführt. In dieser Arbeit wurde aber der Grundstein für tiefere Untersuchungen des viralen Genoms und seines Infektionsmechanismus gelegt. Die Schaffung eines Meerschweinchen-Adenovirus-Modells kann dann Antwort auf weitere Fragestellungen liefern, zum Beispiel zur Tumorentstehung nach der Infektion von Nagetieren mit humanen Adenoviren und der Pathogenität im Meerschweinchen Wirtsorganismus.
URL: https://ediss.sub.uni-hamburg.de/handle/ediss/8574
URN: urn:nbn:de:gbv:18-ediss-86930
Dokumenttyp: Dissertation
Betreuer*in: Dobner, Thomas (Prof. Dr.)
Enthalten in den Sammlungen:Elektronische Dissertationen und Habilitationen

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