Titel: Designing tools for point-of-care diagnostics and biosensing for low-resource settings
Sprache: Englisch
Autor*in: Kumar, Sujatha
Schlagwörter: Point-of-care; Paperfluidics; Kinesin; Radiofrequency; Quantum dots
Erscheinungsdatum: 2021
Tag der mündlichen Prüfung: 2021-09-15
Zusammenfassung: 
Point-of-care and biosensing devices are in great demand to detect infectious and non-infectious diseases, especially in low-resource settings. Key technical challenges for successful instrument-free platforms are: 1) perform multistep assays, 2) ability to process different sample types, 3) incorporate sensitive detection methods, 4) dry storage and stability of reagents, 5) minimal user-steps for ease-of-use, 6) rapid detection time and, 7) low-cost for affordability. This thesis addressed these challenging tools with different approaches in three parts.

Part I: Low-cost paper-based point-of-care diagnostic devices for infectious diseases
First, a two-dimensional paper network (2DPN) device with onboard dry reagents that automated multistep ELISA in 15 minutes, with one user step, was designed and demonstrated for a malarial marker. The dry reagents for ELISA in the porous matrix showed excellent long-term stability at high temperatures.
Next, three sample processing 2DPN devices were developed: i) an integrated card for IgM detection that efficiently removed assay interfering IgG, ii) an integrated device with a user-friendly blood acquisition module that demonstrated plasma separation, lysis of Ebola virus-like particles, and detection of surface glycoprotein marker and, iii) a low-cost microfluidic "origami" device that extracted bacterial DNA from a viscous simulated sputum sample.
Finally, 2DPN for isothermal nucleic acid amplification for a MRSA DNA target in porous matrices was established. A method for storing dry reagents for amplification and detection was developed with remarkable long-term stability. A sample-to-result test for a Chlamydia trachomatis target in the urine sample was demonstrated in a multiplexable, disposable NAAT device operated by a programmed USB-powered board with real-time fluorescence detection using a cellphone.

Part II: Biomolecular motor-powered biosensing
Using kinesin motor proteins as a power source for active transport of a "molecular shuttle" made up of functionalized microtubules, an immunoassay for a heart attack marker was demonstrated on a glass chip. A fluorescence signal enhancement step was established. A method for long-term dry storage of the complex protein assemblies on a glass-chip was developed.

Part III: Label free biosensing
An electronic interface to biological pores in lipid bilayer using micro-coaxial probes to couple radiofrequency circuitry was developed as a fast readout technique for real-time sensing of single molecules. Radiofrequency response to alamethicin ion channels and α-hemolysin (α-HL) pores were observed. The open-close state of the α-HL pore using β-cyclodextrin (β-CD), a channel blocker, was recorded by measuring changes in microwave-frequency transmission through the pore correlating simultaneously with conventional single-channel DC recordings.
Finally, the interaction of colloidal quantum dots (QDs) with an artificial lipid membrane was examined in an electric field using a planar lipid bilayer experimental setup. Voltage-dependent current bursts were observed due to the presence of a large permanent dipole moment in the QDs. The formation of colloidal QD aggregates leading to pore formation is discussed.

Behandlungsort- und Biosensorik-Geräte sind sehr gefragt zur Erkennung von infektiösen und nicht-infektiösen Krankheiten, besonders im ressourcenarmen Umfeld. Die wichtigsten technischen Herausforderungen für erfolgreiche gerätefreie Plattformen sind: 1) Durchführung von Mehrschritt-Assays, 2) Fähigkeit, verschiedene Probentypen zu verarbeiten, 3) Einbindung empfindlicher Nachweismethoden, 4) trockene Lagerung und Stabilität der Reagenzien, 5) minimale Benutzerschritte für eine einfache Bedienung, 6) schnelle Nachweiszeit und 7) erschwingliche Kosten. In dieser Abhandlung wurden diese anspruchsvollen Instrumente in drei Teilen mit unterschiedlichen Ansätzen behandelt.

Teil I: Kostengünstige papierbasierte Behandlungsort-Diagnosegeräte für Infektionskrankheiten
Zunächst wurde ein zweidimensionales Papiernetzwerk (2DPN) mit Onboard-Trockenreagenzien entwickelt und demonstriert, das einen mehrstufigen ELISA für einen Malariamarker in 15 Minuten und mit nur einem Bedienerschritt automatisiert. Die Trockenreagenzien für den ELISA zeigten in der porösen Matrix eine ausgezeichnete Langzeitstabilität bei hohen Temperaturen.
Als nächstes wurden drei probenverarbeitende 2DPN-Geräte entwickelt: i) eine integrierte Karte für den IgM-Nachweis, der für den Assay störende IgG effizient entfernte, ii) ein integriertes Gerät mit einem benutzerfreundlichen Bluterfassungsmodul, das Plasmatrennung, Lyse von Ebola-Virus-ähnlichen Partikeln und den Nachweis von Oberflächenglykoprotein-Markern ermöglichte, und iii) ein kostengünstiges mikrofluidisches “Origami“-Gerät, das bakterielle DNA aus einer viskosen, simulierten Sputum-Probe extrahierte.
Schließlich wurde ein 2DPN für die isotherme Nukleinsäureamplifikation für ein MRSA-DNA-Ziel in porösen Matrizes etabliert. Es wurde eine Methode zur Lagerung von Trockenreagenzien für die Amplifikation und den Nachweis mit bemerkenswerter Langzeitstabilität entwickelt. Ein „Sample-to-result“-Schnelltest für den Nachweis von Chlamydia trachomatis in der Urinprobe wurde in einem multiplexfähigen Einweg-NAAT-Gerät demonstriert, das von einer programmierten USB-betriebenen Platine mit Echtzeit-Fluoreszenznachweis über ein Mobiltelefon betrieben wird.

Teil II: Biomolekulare, motorbetriebene Biosensorik
Unter Verwendung von Kinesin-Motorproteinen als Antriebsquelle für den aktiven Transport eines “molekularen Shuttles“ aus funktionalisierten Mikrotubuli wurde ein Immunoassay für einen Herzinfarktmarker auf einem Glas-Chip demonstriert. Es wurde eine Fluoreszenzsignalverstärkung etabliert. Es wurde eine Methode zur trockenen Langzeitlagerung der komplexen Protein-Baugruppen auf einem Glaschip entwickelt.

Teil III: Etikettenfreie Biosensorik
Es wurde eine elektronische Schnittstelle zu biologischen Poren in Lipiddoppelschichten unter Verwendung von mikrokoaxialen Sonden zur Kopplung von Hochfrequenzschaltungen als schnelle Auslesetechnik für die Echtzeitabtastung von Einzelmolekülen entwickelt. Es wurde die Hochfrequenz-Antwort auf Alamethicin-Ionenkanäle und α-Hämolysin-Poren (α-HL) beobachtet. Der offene/geschlossene Zustand der α-HL-Pore unter Verwendung von β-Cyclodextrin (β-CD), einem Kanalblocker, wurde durch die Messung von Änderungen in der Mikrowellenfrequenzübertragung durch die Pore aufgezeichnet, die gleichzeitig mit konventionellen Einkanal-DC-Aufnahmen korrelierten.
Schließlich wurde die Wechselwirkung von kolloidalen Quantenpunkten (QDs) mit einer künstlichen Lipidmembran in einem elektrischen Feld unter Verwendung eines planaren Lipiddoppelschicht-Versuchsaufbaus untersucht. Aufgrund des Vorhandenseins eines großen permanenten Dipolmoments in den QDs wurden spannungsabhängige Stromstöße beobachtet. Es wird die Bildung von kolloidalen QD-Aggregaten, die zur Porenbildung führen, diskutiert.
URL: https://ediss.sub.uni-hamburg.de/handle/ediss/9215
URN: urn:nbn:de:gbv:18-ediss-95401
Dokumenttyp: Dissertation
Betreuer*in: Blick, Robert
Enthalten in den Sammlungen:Elektronische Dissertationen und Habilitationen

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